中國生物工程學會會刊 ? ? 創刊于2005年

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納米孔測序技術發展態勢分析

時間:2018-05-17來源:未知 作者:丁陳君 陳方 陳云偉 鄭穎 鄧勇 點擊:

自2003年“ 人類基因組計 劃”完成之后,測序技術發展迅 猛,測序讀長不斷加長、通量不 斷提升、時間不斷縮短,基因組 測序技術成本大大降低,逐漸成 為一項常規技術,測序物種數量 和物種多樣性與日俱增。2005 年,第二代測序技術即高通量 測序技術應運而生,并得到廣泛 應用[1]。

納米孔測序技術是近年來 在基因測序領域興起的一項新 技術,起源于1996年哈佛大學的 Daniel Branton、加州大學的David Deamer等用膜通道檢測多核苷酸 序列的實驗結果[2]。其主要原理 是讓單鏈DNA的堿基逐個穿過 1nm的小孔,檢測不同堿基組合 的特有結構在穿過時產生的電流 變化來進行測序。該測序技術無 需預先擴增或標記DNA,可以 降低測序成本,且可以連續讀取 長片段的DNA序列,分析速度 也大大提高,基于這些優勢該技 術已受到廣泛關注,被認為是最 有可能成為下一代基因測序的技 術之一。2016 年,《科學》雜志 已將基于納米孔的便攜式檢測技 術評為十大科技突破之一。2014 年6月,瑞士羅氏集團收購納米 孔測序公司Genia Technologies。 該次收購將加強羅氏新一代測序 平臺。幾乎同期, 羅氏還收購 了另一家納米孔測序公司Stratos Genomics。此外, 作為牛津納 米孔技術公司早期的主要股東之 一的Illumina公司迫于競爭壓力 不得不與牛津納米孔技術公司對 簿公堂,以搶占該領域的核心專 利。Illumina和羅氏公司加緊在納 米孔測序技術領域的布局凸顯了 該技術廣闊的發展前景。

納米孔測序技術自其理論誕 生以來已發展了20年,最初的理 念非常直觀,但實施過程中遇到 很多問題。在美國國立衛生研究 院“1000美元基因組計劃”的激 勵下,越來越多的研究人員加入 到解決堿基穿過納米孔時的檢測 手段、穿過速度以及納米孔本身 的改良等技術難題的行列。

2005年,由于IP集團種子基 金的資助,英國牛津納米孔技術公 司(Oxford Nanopore Technologies) 成立,并于2012年發布其納米孔 測序平臺——MinION。該平臺只 有U盤大小,價格僅1000美元左 右,能對很長的DNA進行測序, 由此開啟了納米孔測序技術的商 業化新篇章。2013 年11月,該公 司啟動MinION測序儀的早期試 用計劃。2014年的基因組生物技 術進展大會上,首批試用數據公 布于眾。隨后其他各試驗項目的 數據陸續發布。英國埃克塞特大 學研究小組對MinION 的性能進 行了評估,他們認為作為首個基 于納米孔的單分子測序儀,MinION 前景值得期待,但目前約38%的錯 誤率則限制了其競爭力[3]。瑞典于 默奧大學研究小組利用MinION 構建細菌基因組骨架,序列讀取 還有待改進,但未來在組裝基因 組、現場快速檢測生物體方面的 應用令人期待[4]。

2009年3月,美國納米孔測序 公司Genia Technologies 成立,其 傳感器技術及其專有的NanoTag 化學技術可以實現準確讀取,克 服了早期納米孔測序工作面臨的 諸多限制。

2015年,牛津納米孔技術公 司創始人Hagan Bayley和牛津大學 等研究人員在高通量檢測納米孔離 子流變化情況方面取得突破性進 展。他們開發了光傳感納米孔芯 片,將納米孔離子流變化轉化為熒 光變化,從而進行高通量檢測[5]。 2016 年3月,美國哈佛大學和哥 倫比亞大學團隊開發了基于納米 孔的單分子邊合成邊測序(SBS) 系統,可以在單分子水平上對多個 DNA模板進行平行測序,分辨率達 到了單堿基水平[6]。

1 研發現狀分析

1.1 文獻計量

以科學引文索引擴展版(science citation index expanded,SCI-E)作 為數據源對納米孔測序技術進行 文獻檢索,文獻類型不限,相關 論文共1091 篇(檢索時間2017 年 4 月5 日)。

通過對納米孔測序技術的論文 進行統計后發現,該技術論文數量 增長較為緩慢,說明其技術發展較 為慢熱(圖1)。隨著技術的不斷 發展,商業化進程的推進,納米孔 測序技術也將日益受到關注。

1.1.1 國家分布

從發文量TOP10國家來看, 美國具有絕對的優勢,共發表納 米孔測序技術領域的論文548 篇, 是排名第二的中國的近3 倍。英 國排名第三,排名第4 ~ 10的國 家發文量差異不明顯(表1)。

從被引情況來看, 發文量 TOP10國家中,篇均被引次數前 三的分別是英國、加拿大和美 國,分別為50.37、48.63 和38.08 次,篇均被引次數最少的是瑞 典, 為11.3 次( 表1)。將被引 次數50 以上的論文作為高被引 論文進行統計發現,美國、英國 和中國的高被引論文發文量居于 前三;加拿大、荷蘭和瑞士高被 引論文量占發文總量的比例最 大,其次是美國和英國(表2)。 結合發文量和被引情況可以看 出, 美國、英國和加拿大在納 米孔測序技術領域相對具有較強 的研發實力。



 

1.1.2 主要研究機構

在開展納米孔測序技術研究 的機構中,美國加州大學系統發 表相關論文數量最多(78篇),美 國伊利諾伊大學系統和中國科學 院分別發表65篇和46篇,位列第 二和第三(圖2)。在發文量前十 位研究機構中,有7家美國機構, 2家中國機構和1家英國機構。

1.1.3 國際合作

從開展納米孔測序技術研究 的機構合作情況來看,位于前十 的機構除加州大學圣克魯茲分校 與華盛頓大學和加州大學圣克魯 茲分校與哈佛大學之間的合作較 頻繁之外,其余幾所機構之間的 合作并不緊密。美國猶他大學幾乎獨立開展研究(圖3)。包括 中國科學院在內的這些機構都 位于小的合作網絡中心,說明 這些機構都具有較強的研發水 平,開展以各自為主導的國際 合作研究。

1.2 專利分析

以湯森路透Web of Science平 臺中Derwent Innovations IndexSM 數據庫(DII數據庫)作為數據 源,分析納米孔測序技術專利的 發展情況(數據下載日期為2017 年5 月31 日)。

1.2.1 時間趨勢

從圖4 可以看出納米孔測序 技術相關專利保護情況的年度發 展趨勢,1999 ~ 2016 年該技術 發明專利數量總體呈緩慢增長趨 勢,1999 ~ 2004 年主要處于技 術引入期,2005 ~ 2009 年專利 公開數量沒有大的突破,處于技 術瓶頸期,許多技術仍處于研發 階段,2010 年以后納米孔測序 技術進入快速發展階段,尤其是 2012 年首臺測序儀問世標志著 技術真正實現商業化,專利公 開數量激增,至2016 年已達到 101 件( 圖4)。這一趨勢說明 納米孔測序技術已逐漸受到各 界重視。

1.2.2  專利受理國家/地區分布

由相關專利受理國家/ 地區 分布情況可以看出,美國、歐 洲、中國是納米孔測序技術專 利申請人最重視的市場保護地, 其次是日本、加拿大、澳大利亞(圖5)。

1.2.3 主要申請機構

由納米孔測序技術的主要申 請機構可以看出,英國牛津納米孔 技術公司、美國Genia Technologies 公司和美國Pacifi c Biosciences公司 的專利申請數量居全球前三。專利 申請數量TOP10機構中,除英國 牛津納米孔技術公司和瑞士羅氏公 司以外,其余8家機構均為美國機 構,其中6 家為美國公司,還有 2 家為加州大學和哈佛大學,可 見美國在該領域具有壟斷優勢 (圖6)。

1.2.4 相關專利的研發重點 將納米孔測序技術專利根據 國際專利分類號進行分類,專利 申請數量最多的10個分類號如 表3所示。根據分類號對應的注 釋可知,目前納米孔測序技術相關專利主要集中在包含酶或微生 物的測定或檢驗方法;其所用的 組合物或試紙;組合物的制備方 法;在微生物學方法或酶學方法 中的條件反應控制(C12Q) 領 域,其次是借助于測定材料的化 學或物理性質來測試或分析材料 (G01N)領域等。

 

2 應用前景 2.1 即時檢測傳染源 第二代測序平臺的廣泛使 用,填補了之前在傳染病爆發時 診斷檢測方面的缺口,但與PCR、 ELISA技術一樣,存在檢測時間 過長的問題,而納米孔測序技術 能很好地彌補這方面的不足。

 

2015年4月,歐洲移動實驗 室項目(EMLP) 成員和美國 NIH的團隊利用MinION測序儀 在48h內讀取了14名患者的埃博 拉基因組,由此幫助醫生診斷患 者病因,并快速繪制系統發育樹, 從而確定感染的源頭。2016年2 月3 日,Nature首次報道了利用 納米孔測序技術對埃博拉病毒進 行實時測序的成功例子[7]。

 

2.2 基因組組裝 英國埃克塞特大學在評估MinION系統時發現,結合Illumina MiSeq數據,并依靠其長讀長的 優勢在基因組復雜區域組裝方面 具有良好的效果[3]。 2016 年12月初,牛津納米孔 技術公司主辦的行業交流會上宣 布首次使用Oxford Nanopore掌上 測序儀完成了對一個人類標準樣 本NA12878的測序和一位牛津生 物醫學研究中心的患者的測序, 由此打開了大規模使用納米孔測 序技術的大門。

 

2.3 基因診斷 哈佛大學研究小組開發了一 種基于納米孔的電子DNA測序 平臺。這個新的測序機器包括7 個蛋白質亞基,共同組成了1 個 復雜的納米孔,其中只有1 個可 以在正確的孔道開放時間、正確 的位置特異性地與DNA聚合酶 共軛[8]。該成果將生物大分子機 器與合成膜結合在一起,然后 整合到常規電子機器中,創造 了一種全新的低成本基因診斷 技術。

 

2.4 太空應用 2016年7月,一臺MinION測 序儀搭乘SpaceX 9號進入國際空 間站,對細菌、病毒和小鼠DNA 進行測序,所得數據發回地球, 在此基礎上研究人員對MinION 在不同環境下的工作狀態進行評 估,以驗證MinION在微重力下的 性能,并為下一步探索做好準備, 為未來更多科學研究提供支持。 此外,小型便攜式DNA測序 儀還在科研、藥物定制、食品安 全檢測、農作物科學研究、環境 監測以及安全防護等許多方面具 有應用潛力,在推進基于基因組 技術的個性化醫學方面也將做出 巨大貢獻。

 

3 結 論 通過文獻計量和專利分析來 看,目前納米孔測序技術仍處于 發展初期,許多技術還在研發 階段, 受關注程度不太高。美 國、中國和英國在納米孔測序技 術領域發文量方面居前三位。美 國和英國在高被引論文發表數量 和發文總量占比方面處于領先地 位。在專利申請方面,產業界的 申請人占多數,美國專利權人在 納米孔測序技術專利申請方面具 有壟斷優勢。加州大學和哈佛大 學在論文發表和專利申請方面都 居于世界前列。中國科學院和東 南大學是發表相關論文總數進入 TOP10機構。由發文量、發文質 量和專利申請數量的機構排名可 以看出,美國和歐洲都具有很強 的研發實力,并且這些國家/地 區的市場也十分受重視。

 

目前,納米孔測序技術正向 著長讀長、高通量、低成本和小 型化的方向發展,與其他主流測 序技術相比,在速度和成本方面 已顯現一定的優勢,并且應用領 域相當廣泛。未來,該技術在從 測序原理到制造工藝,尤其是序 列讀取錯誤率和平行測序能力方 面還有很大的改進空間。

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