中國生物工程學會會刊 ? ? 創刊于2005年

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工業生物過程高效轉化與系統集成

時間:2019-04-09來源:未知 作者:譚天偉 秦培勇 點擊:

工業生物技術是以生物學、化學和化學工程學等學 科為基礎、以生物催化和生物轉化為核心,研究大規模 生產化學品、醫藥、能源和材料的新過程和新方法的學 科,是以可再生生物質資源為原料的、環境友好的新型 物質加工模式,是化學工程和生物技術有機結合的新制 造技術的典范[1]。隨著能源、資源、環境問題的日趨嚴 峻,工業生物技術已經成為世界各國的戰略研究方向。

我國在工業生物過程優化和系統集成研究方面 與國外差距較大,具體表現在原料利用率和產品回 收率低、能量消耗高,發酵工業排放COD(化學需 氧量)占全國工業COD總排放量的19%。主要原因 是工業生物過程是一個具有生命特征的動態復雜系 統,目前對多變、復雜生物原料的定向/高效轉化 機制還不十分清楚,導致生物轉化體系效率低、副 產物多、COD排放高;產物濃度低,導致分離精制 能耗高、收率低;生物過程子系統中物質流和能量 流的割裂設計,以及對整個工業生物過程缺乏系統 科學研究,導致整個系統高能耗、高物耗、高排放、 整體經濟性差。

針對上述問題,國內工業生物技術主要優勢單 位包括北京化工大學、天津大學、江南大學、中國科 學院過程工程研究所、清華大學、華東理工大學、南京工業大學、中國科學院天津工業生物技術研究所 等于2013年聯合承擔了“973”項目“工業生物過程 高效轉化與系統集成的科學基礎研究”,經過幾年的 聯合攻關,在生物原料高效/定向轉化機制、工業生 物過程物質/能量流耦合規律、工業生物過程強化和 系統集成原理3個關鍵基本科學問題研究方面取得一 定的成就;探究出如何實現復雜生物原料高效與定向 轉化,過程強化和系統集成,為實現工業生物全流程 “吃得凈、吃得快、排的少”奠定方法基礎(圖1)。

1 生物原料高效轉化是可持續發展的重要發 展方向

目前,我國非糧生物質資源豐富,其高效轉化與利用具有巨大的發展空間[2-3]。但生物質原料成分 復雜,可能含有有毒代謝物和重金屬離子對目標微生 物產生外界壓力,而微生物細胞在受到外界壓力和危 險時能夠立即采取“應激”行為,因此需要對微生物 高效轉化及胞內/胞外代謝“應激”機制進行解析。

天津大學等單位針對劣質生物原料中存在多種 抑制劑的問題,研究了釀酒酵母菌株對復合抑制劑 的“應激”機制[4] ;發現纖維素轉化過程中會有多 種抑制劑產生[5-7],解析復合抑制劑的耐受機制對纖 維素高效生物轉化具有重要的意義。國際上,美國 農業部研究中心和蘇黎世理工大學也在這方面展開 研究。國外單位主要是針對單一抑制劑成分的抑制 機理進行解析。天津大學從實際生產過程出發,解 析水解液中復合抑制劑的耐受機制,選育了復合抑 制劑耐受菌株菌種,建立了釀酒酵母對抑制劑的耐 受能力快速提升策略[8] ;獲得了針對纖維素水解液 中抑制劑的典型代表(1.3g/L糠醛、1.5g/L苯酚和 5.3g/L乙酸的混合物)的耐受菌株,在抑制劑存在 下發酵周期由141h縮短到21h[8-9],申請了中國發明 專利(CN201110238038.90);發現了新的抑制劑耐 受機制,通過解析抑制劑耐受菌株和原始菌株的差 異,以及菌株對抑制劑的響應,建立了釀酒酵母耐 受抑制劑的機理模型[10-12] ;發現了肌醇和脯氨酸是 與菌株耐受性相關的重要代謝物,通過降低和提高 肌醇和脯氨酸的含量可以顯著降低和提升菌株的復 合抑制劑耐受能力,并同時發現了活性氧是脯氨酸 調控菌株耐受能力的關鍵中介[9]。

總之,在復雜生物原料體系中系統研究胞內/胞 外代謝物互補調控的規律,有助于提高微生物對生 物質的轉化效率、減少污染、降低成本。突破傳統 利用優質生物原料制備單一產品的模式,實現劣質 生物質原料的高效和充分利用及產出的利益最大化。

2 物質/ 能量流高效利用是提高工業生物過 程轉化效率的重要途徑

傳統提高目標產物生產效率的主要方法是強化 微生物胞內代謝網絡。事實上,若只對物質代謝 網絡進行強化,結果常常不盡人意。造成該現象 的主要原因之一是微生物胞內能量因子(如ATP、 NADH和NADPH等)與物質流代謝不匹配。微生 物胞內物質代謝網絡實質是由伴隨能量因子轉化與 再生的氧化/還原反應等體系組成;近年研究結果表 明,生物基化學品的合成途徑都涉及ATP、NADH 及NADPH等能量因子[13],如何實現微生物細胞內 物質/能量流的高效匹配,對復雜生物原料的高效和 定向轉化具有重要的意義。

江南大學等單位針對細胞內酮酸發酵過程的 物質和能量集成原理及關鍵技術等方面進行了大 量研究。通過對α-酮戊二酸生產菌株Y. lipolytica WSH-Z06進行全基因組測序和分析得到6條多功能 的酮酸轉運蛋白,從酮酸轉運機制層面揭示了其積 累α-酮戊二酸的機制[14]。基于Y. lipolytica WSH-Z06 發酵生產 α-酮戊二酸過程的特點,建立了一種高通 量篩選方法,快速實現了α-酮戊二酸高產菌株的篩 選[15]。應用比較基因組學分析α-酮戊二酸產量突變 菌株與野生菌株之間的差異,揭示了與α-酮戊二酸 代謝途徑相關的控制線粒體合成、調控能量代謝和 調控氨基酸和酮酸轉化等基因對α-酮戊二酸的積累 的影響[16]。基于α-酮戊二酸代謝調控機制解析,采 用工業育種與高通量篩選技術相結合的方法,使α-酮 戊二酸轉化率達到50.57%。該技術已在5家國內企 業實施,近三年累計新增產值6.21億元,利稅2.43 億元,出口創匯1902萬美元。酮酸發酵法制備關鍵 技術及產業化獲得2015 年國家技術發明二等獎。

在宏觀層次上,工業生物過程與工藝的物質/能 量協同作用是生物原料高效轉化的另一個關鍵。北 京化工大學通過把體現工業生物過程特性的物質和 能量傳遞規律與耦合控制原理相結合,以“原料- 轉 化-分離-廢物資源化利用”一體化為優化主導思想, 研究胞外工藝過程中的物質流與能量流的匹配規律, 對中糧豐原生化燃料乙醇精餾工段進行了設計和改 造[17]。利用攜帶高品位能量(如高溫)而又需要冷 卻的物質流和需要加熱的低品位能量物質流進行非 接觸式能量交換, 達到加熱和冷卻耦合的目的;精餾 塔系統由粗塔、精塔和二精塔等組成,塔頂蒸汽采 用不同的壓強梯度,高壓強的塔頂蒸汽與相鄰精餾 塔再沸器進行熱交換并作為熱源,即利用二精塔的 塔頂蒸汽給精塔再沸器加熱,精塔塔頂蒸汽給粗塔 再沸器加熱。形成了原料利用合理化、過程能耗最 低化、廢物排放和環境污染最小化的生物過程優化 控制和系統優化方法。產量由原來的6萬噸/年提升到了11.6萬噸/年,蒸汽由原來的2.2噸蒸汽/噸酒精 降低到1.5噸蒸汽/噸酒精,年節約冷卻水402萬噸, 2015 年新增經濟效益1298 萬元。

南京工業大學等單位在聚氨基酸工業生物過程 的系統優化原理與調控規律方面進行了深入的研究。 針對因聚氨基酸生物合成機理信息缺乏導致的合成 效率低下的瓶頸,項目組在世界范圍內率先對ε-PL (ε-聚賴氨酸)生產菌S. albulus PD-1的全基因組進 行測序(GenBank No :AXDB00000000), 結合中 間代謝產物與關鍵酶活力檢測技術完善了S. albulus PD-1的代謝網絡[18]。首次在S. albulus PD-1代謝產 物中發現另一種新型的聚氨基酸——聚二氨基丙酸 (PDAP),并通過加入小分子代謝調節劑,實現了 ε-PL 和PDAP的可控聯產,研究發現檸檬酸對ε-PL 和PDAP的共生有明顯調控作用,檸檬酸的添加使 得ε-PL合成途徑的流量顯著增加,胞內還原力水平 提高,有利于ε-PL的合成[19]。ε-PL發酵時間由120h 縮短至80h,比國際最高水平的日本窒素公司耗時少 近一半[20]。聚谷氨酸作為生物高分子,伴隨著產物 積累,體系變得十分黏稠,針對營養物質傳質困難 的問題,采用放射性14C同位素示蹤技術系統研究了 菌株中底物跨膜運輸的機理,并針對菌株生長與底 物轉運兩者最佳pH的不一致,創造性地采用了pH 分步調控策略,提高菌體吸收營養的能力,使底物 轉化率達到90.5%的國際最高水平[21]。在以上理論 發現和技術創新的基礎上,實現了生物法制備聚氨 基酸高效低成本的系統優化。該研究獲得了2014 年 國家技術發明二等獎。

總之,要充分考慮“原料-反應-分離-廢物排 放一體化”,進行整個工業生物過程從胞內到胞外的 物質和能量匹配設計,實現物料流和能量流在整個 工業生物過程中的合理分配、副產物和目標產物的 優化調控、廢渣廢水的最優利用等。

3 過程強化與系統集成是工業生物技術增效 降耗、節能減排的重要手段

過程強化已成為過程工業重要的前沿發展方向。 過程強化可顯著提升工業生物過程的轉化效率。因 此,探究工業生物過程“三傳一反”協同作用機制, 對工業生物過程節能降耗具有重要的意義。

清華大學等單位在從丙烯腈生產丙烯酰胺的過 程強化方面進行了大量的研究。日本和中國分別在 1985年和1994年以野生紅球菌和野生諾卡氏菌為生 物催化劑實現了丙烯酰胺的產業化。但在工業生產 過程中一直存在細胞和胞內酶的抗逆性差以及副產 物積累問題,導致原料單耗增加、分離純化成本提 高、反應效率下降、能耗高以及廢水排放多。清華 大學從細胞催化劑性能和過程工藝兩個層面進行能 質耦合強化和反應過程強化改造,使生物催化劑在 工業環境中高效穩定運行。

發展了熱不對稱PCR耦合反向PCR染色體步移 技術;建立了紅球菌轉座體隨機敲除、單基因定點 敲除以及雙基因疊加敲除的方法;利用同源單交換 重組,成功敲除了腈代謝酶系中主導副產物生成的 酰胺酶基因,獲得了低副產物基因工程紅球菌TH3 (ZL200880000969.1)[22]。該紅球菌染色體酰胺酶基 因敲除方法,通過了PCT國際專利新穎性、創造性 和工業實用性審查(WO2009/117843),并被授予美 國發明專利(US8518685)。構建的基因工程紅球菌 TH3已成功用于丙烯酰胺產業化,解決了生產過程 中副產物積累、原料損耗問題,游離細胞催化水合 副產物量<0.07%,下降70% ~ 80%,精制離子交換 過柱量提高了55%,廢水排放下降30%,每年減少9 萬噸以上廢水排放量,發酵原料成本下降40%,丙烯 腈單耗從0.80 ~ 0.82kg/kg丙烯酰胺下降為0.76kg/kg 丙烯酰胺,接近理論值0.75kg/kg丙烯酰胺。自2009 年8月實現產業化應用到2013年年底,TH3菌株新 增利潤2.68億元,上交稅金1.50億元,創收外匯925 萬美元,節支1580 萬元,經濟和社會效益顯著。

開發了游離細胞催化耦合中空纖維超濾膜分離 新工藝[23]。解決了原固定化細胞工藝中酶活損失大、 雜質含量高的問題,菌體利用率提高60%~ 70%, 水合產物雜蛋白降低到5×10-4%以下,游離細胞使 用批次從3 ~ 5批提高到6 ~ 10批,并在年產5 萬 噸規模丙烯酰胺工業生產中穩定高效運行,被授予 中國發明專利ZL03109806.1。

以產重組腈水合酶的基因工程紅球菌游離細胞 為催化劑的丙烯酰胺生產工藝實現了高效、低耗 (能耗/物耗)、低成本、低排放的全局過程優化,獲 得2016年東營市科學技術合作獎及2013年中國石油 和化學工業聯合會技術發明二等獎。

再者,工業生物過程是一個上中下游多過程集 成系統,雖已對各單元過程進行了大量的優化研究, 但還缺乏單元子系統之間集成與優化研究,因此工 業生物過程效率仍較低、三廢排放高,造成一定環 境問題。

華東理工大學等單位在工業生物過程集成和系 統優化方面做了大量的工作。將用于描述質量與能 量集成和耦合的模型與反應器流場模擬相結合,建 立了一種基于過程流場時空特征的動力學數值模擬 框架[24]。該數值模擬框架由兩部分整合而成,其 一,微生物細胞響應外界環境時序改變的動力學數 值模擬;其二,通氣攪拌生物反應器中的氣液兩相 流模擬,以及微生物細胞在反應器流場氣液固三相 中的流動軌跡模擬。通過模擬,不僅能夠實現對生 物反應器內環境不均一度(底物、溶解氧、前體、 菌體等)的數值模擬,更可以基于不同微生物的歷 史經歷對其在不同位置的性能(比產物合成速率、 比菌體生長速率、比底物消耗速率、比氧消耗速率 等)進行評估。利用模擬結果更易于針對性地就特 定設備和反應條件的問題提出解決方案,進行理性 優化和放大。這一數值模擬框架已被成功用于青霉 素好氧發酵過程和紅花植物細胞培養的研究[25]。以 120m3生物反應器中的青霉素發酵過程為對象,利 用該動力學數值模擬框架對100萬個獨立顆粒(微 生物簇)進行演算,獲得了獨立顆粒對流場時空特 性響應的物質能量代謝特征[26]。

在大規模復雜工業生物過程的快速高效多目標 優化算法方面,經過系統分析目前各類智能優化算 法的性能和特點,以局部和全局尋優性能兼備的差 分進化算法為基礎,進行適用于大規模復雜工業生 物過程的快速高效多目標優化算法的研發,先后提 出參數自適應的多目標差分進化算法(PBMODE)、 變異策略和參數共同自適應的多目標差分進化算法 (APBMODE)[27],并應用于發酵過程多目標優化問 題的求解,以基于廣義計量反應方程和冪級數結構 的發酵動力學模型為基礎[28-29],分別構建產物最大 化、底物轉化率最大化兩個優化目標,以初始菌體 濃度、初始底物濃度、實時溶氧比為優化變量,進 行尋優,獲得最佳的優化結果。

上述理論已被成功用于工業化生產,在宜都東 陽光、北方藥業、維爾康、山東福洋等企業,實現 了青霉素、紅霉素、維生素B12、慶大霉素C1a等多 個產品從實驗室規模到工業化規模的放大,產量提 高20%以上。2015 ~ 2016 年實現產值11億余元。 總之,工業生物過程系統的整體效率受制于系 統內各單元的優化與系統集成,其中某一過程或層 次常常為該系統的限速步驟。因此需要采用系統工 程研究方法確定關鍵子系統并加以調控,實現整個 工業生物系統的多目標集成與優化。

4 總結與展望

綜觀我國工業生物技術發展的現狀與趨勢,生 物技術產業還缺乏集成創新和系統設計研究,造成 復雜生物原料轉化效率低、三廢排放高等。因此, 急需布局工業生物過程高效轉化與系統集成研究。 項目組致力于對生物原料高效/定向生物轉化機制、 工業生物技術微觀(細胞)和宏觀(過程)層次上 的物質和能量耦合規律、過程系統集成與優化原理 等關鍵科學問題進行深入研究,提出了基于脅迫因 子響應和菌群協同效應的生物高效轉化新機制以及 基于物質流與能量流耦合的過程強化新思路,形成 了一批具有一定國際影響力的成果,推動了我國工 業生物技術在過程科學方面的研究。

 

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