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腫瘤精準免疫治療與基因檢測

時間:2019-04-09來源:未知 作者:高志博,楊錦 點擊:

2016 年發布的《2015 年中國癌癥統計》顯示, 僅在2015 年,中國共有429.2 萬新發腫瘤病例和 281.4 萬癌癥死亡病例[1]。癌癥作為一種成因極其復 雜的疾病,至今沒有很好的解決辦法,腫瘤異質性 是腫瘤難以根治的主要原因。腫瘤異質性最典型的 體現是個體間的異質性,還包括個體內不同部位或不 同時間發生的異質性,主要表現在癌細胞的基因變化 上,因此才會有各種各樣的癌癥標志物,并引申出了 癌癥分類和個性化治療的概念。傳統的癌癥分類是按 照腫瘤發生的部位進行命名和劃分的,在基因時代, 對腫瘤的認識上升到分子層面,基因突變越來越被認 為是導致腫瘤的因素。如泛癌癥研究就是建立在對多 種腫瘤基因組進行詳細分析的基礎上對癌癥進行分 類,它從基因水平上尋找跨越組織界限的癌癥共同特 征,從而讓癌癥患者得到更為匹配和精準的治療。 相關研究離不開先進的基因測序和診斷技術的 支撐,測序成本的降低使得癌癥測序從實驗室走向 市場;而癌癥基因組大數據的積累,則為癌癥治療 提供了數據基石,癌癥的密碼皆藏于雙螺旋之中, 解開這一密碼將能夠實現腫瘤的精準治療。

越來越多的臨床證據表明,許多腫瘤內源性突變會被加工成多肽,呈現到癌細胞表面,被自體免 疫T 細胞識別。高通量測序(NGS)在腫瘤和免疫 學研究中已經顯現出巨大的潛力,推動了個體化和 精準免疫治療的發展,提升了人類對腫瘤基因組和腫 瘤發生發展中細胞內機制的理解[2]。高通量測序解決 了基因數據來源的問題,能快速鑒別出個體化腫瘤的 復雜突變圖譜[3];而生物信息分析技術和大數據研究 能從腫瘤基因突變組中找出個體化的腫瘤新生抗原。 在后基因組時代,腫瘤突變組是基因寶庫,蘊藏著尋 找腫瘤特異性靶標的腫瘤新生抗原[4]。

人體免疫系統具有天然識別腫瘤細胞并將其清 除的機制,能識別腫瘤細胞中的突變,通過激活機體 對腫瘤特異性抗原的免疫應答防止腫瘤進展,但是各 種原因使免疫細胞失去對腫瘤細胞的控制,導致了腫 瘤發生。腫瘤免疫治療能夠深刻理解腫瘤微環境、 腫瘤和免疫之間的關聯性,調動和增強人體免疫系統 對抗癌癥的能力,代表了目前最有可能治愈癌癥的療 法。以免疫檢驗點抑制劑和工程改造T 細胞為代表的 免疫治療在腫瘤治療上大放異彩。腫瘤治療中頗有希 望的免疫治療與相對成熟的靶向治療的結合,被公認 為是未來最有希望戰勝腫瘤的方向。

1 腫瘤基因突變與免疫的關系

免疫細胞特別是T 細胞時刻監視外在致病原以及機體細胞的改變,并且通過特異性調節機制在腫 瘤發生發展的長期過程中,起著很關鍵的控制作 用。所以,從某種角度上講,機體的免疫細胞和腫 瘤一起進化發展,具備識別自身腫瘤的特異性以及 消除腫瘤的能力。但是種種原因致使免疫細胞失去 了對腫瘤的控制能力,導致了腫瘤的發生。

從腫瘤來源角度講,腫瘤可以被認為是基因組 疾病,一個正常細胞出現體細胞突變,突變積累到一 定程度就會導致腫瘤的發生。突變包括基因融合、基 因拷貝數變化、單堿基突變、原癌基因異常表達、 mRNA 異常剪接、表觀修飾調控異常、microRNA 調控異常和DNA 甲基化等。新一代測序技術能檢 測出個體腫瘤的全部基因突變圖譜[3],由于腫瘤的 異質性,每個腫瘤患者的腫瘤突變印記(mutation signature)特異性非常高,95%以上的突變具有獨特 性和患者特異性,所有腫瘤共性的突變非常少,這也 是找到腫瘤特異性抗原非常困難的原因,不僅是靶向 藥物治療難以解決腫瘤異質性難題,這也決定了針對 腫瘤突變多樣性的免疫治療一定是走向精準化的[5]。 腫瘤基因組研究能夠從基因水平發掘和認識這些標 志,對于更精細的分子診斷、預后評估和治療方法的 選擇等均具有重要意義,為臨床干預腫瘤提供了有效 的個體化監測手段和免疫治療新靶點[6]。

腫瘤新生抗原是腫瘤突變后產生的能被自體T 細胞識別的突變多肽,激活免疫系統殺傷腫瘤,在 腫瘤免疫臨床治療上發揮了重要作用,如腫瘤浸潤 淋巴細胞(TIL)過繼免疫治療和免疫檢查點抑制 劑療法[7]。最近報道了腫瘤免疫治療領域的引領者 Rosenberg 等[8] 針對KRAS 突變的免疫療法,瞄準的 就是肺腺癌、結直腸癌中很常見的KRAS 基因突變; 另外,也找到了針對腫瘤新生抗原特異的TIL 細 胞,體外擴增回輸后治愈了晚期肝肺轉移的膽管 癌患者[9]。腫瘤新生抗原的數量與免疫檢驗點抑制 劑的療效相關,已經在肺癌、黑色素瘤和膀胱癌等 癌癥的臨床試驗中得到了驗證。

2 基因檢測指導的精準免疫治療

大規模測序技術的發展,尤其是在腫瘤上的 研究,已經積累了海量的腫瘤基因組知識集,既有 TCGA、ICGC 這類的綜合數據庫,也有專門的腫瘤 基因組數據庫、腫瘤DNA 甲基化數據庫、腫瘤轉錄 組數據庫、腫瘤蛋白組數據庫等,極大提高了研究 人員對腫瘤基因組和腫瘤發生發展機制的了解,基 于這些數據庫集,基因檢測指導的腫瘤免疫治療已 經在臨床治療上顯現出巨大潛力。通過高通量測序 技術尋找調節免疫應答的信號通路,確定腫瘤生物 標志物,或增強對腫瘤細胞的靶向識別能力,或削 弱腫瘤細胞躲避免疫系統的能力,將助力腫瘤個體 化免疫治療取得突破。

2.1 免疫檢查點抑制劑療法

PD-1/PD-L1 抗體的藥物研發是人類征服腫瘤歷 史上的一個關鍵突破。這些藥物的抗腫瘤機制不同 于以往的任何藥物,既不是單純地針對腫瘤,也不 是簡單地調節免疫細胞,而是特異性地針對腫瘤微 環境中關鍵免疫逃逸機制,通過改善腫瘤免疫微環 境來控制和清除腫瘤,瞄準的是免疫系統本身。目 前,這種療法在美國、歐洲以及日本均獲得批準, 在中國的臨床試驗也已經開始。它在多種腫瘤治療 中療效顯著,并且效果穩定,副作用比較小,很多 腫瘤病人受益其中。

以PD-1/PD-L1 為代表的免疫檢查點抑制劑近 年來好消息不斷,除了臨床適應證越來越多,新藥 上市步伐也不斷加快,Keytuda 甚至獲批晚期非小細 胞肺癌的一線治療,免疫檢查點抑制劑療法已經在 一些轉移性實體瘤上取得了進展[10-13],由于患者響 應率低(20% 左右),確定哪些患者能從治療中受 益十分必要。PD-L1 表達是PD-1/PD-L1 阻斷劑療法 的主要檢測指標,但是其敏感性和特異性還不足以 預示治療效果[14-16],腫瘤突變負載(tumor mutation burden,TMB)是腫瘤基因組編碼區域內的突變率, 一定時期內具有一致性和可重復性,相關研究評估 證明了TMB 和檢查點抑制劑療法獲益性之間的相關 性,分別在黑色素瘤、非小細胞肺癌、轉移性黑色 素瘤等的療效預測上取得進展[17-21]。此外,Webster 在《藥物發現自然評論》期刊上撰文預測,到2020 年免疫檢查點抑制劑藥物的市場規模將達到70 億美 元[22]。開發中的免疫檢查點見表1。

然而,免疫檢查點抑制劑療法還面臨治療響應 率低的問題,主要是因為沒有好的標志物預測指導患者用藥,這種策略也影響了藥廠的臨床設計,并帶 來不同影響。2016年8月5日,百時美施貴寶公司宣布 了Opdivo一線單藥治療晚期非小細胞肺癌(PD-L1表 達水平≥5%)CheckMate-026 Ⅲ期研究的一線結果, 稱其未能到達顯著改善無進展生存期(PFS)的主要 終點。但2016年6月16日,默沙東公司宣布Keytruda 一線單藥治療PD-L1高表達[腫瘤比例分值(TPS) ≥50%]晚期非小細胞肺癌的KEYNOTE-024關鍵Ⅲ 期研究因為到達主要終點[無進展生存期和總生存 期(OS)]而提前終止。類似的藥物、類似的臨床試 驗,由于生物標志物選擇標準不一樣,一個成功一 個失敗,證明了生物標志物對于抗PD-1藥物療效的 重要作用,因此,識別和表征能夠預測免疫檢查點 抑制劑療法有效性的生物標志物成為當務之急。

高PD-L1 表達水平能在一定程度上預示免疫療 法的獲益性,但是影響PD-L1 表達水平的因素很多也 很復雜,在某一情況下可能跟預后的相關性較好,但 到了另一個環境,因為免疫系統復雜性,預示效果失 去了作用,最明顯的例子是,PD-L1 陰性并不意味著 免疫檢查點抑制劑藥物就沒有作用,事實上PD-1 抑 制劑藥物也有可能發揮作用。一些研究發現,腫瘤突 變負載與免疫檢查點抑制劑療法呈正相關[17-18],但突 變負載是腫瘤基因層面的變化,必須轉變成能被機 體免疫系統識別的抗原才能觸發免疫應答,因此又 有研究人員通過全外顯子測序和RNA 測序尋找腫瘤 突變后產生的抗原標志物——腫瘤新生抗原,通過 測定腫瘤細胞編碼區和已表達的基因,篩選出腫瘤新 生抗原,測定其中與人類白細胞抗原(HLA)受體親和 力相關的抗原表位找到更適合患者的治療方案,實現 個性化的腫瘤免疫治療。精選出的腫瘤新生抗原能被 用于個體化腫瘤疫苗開發和過繼性T 細胞治療。RNA 測序還可用于尋找能影響免疫檢查點抑制劑療法有效 性的細胞因子、亞細胞和腸道微生物群落等腫瘤微環 境因素。

2.2 個體化腫瘤疫苗

2016 年12 月1 日, 美國舊金山的帕克研究所和紐約的癌癥研究所發起腫瘤新抗原篩查聯盟 (Tumor neoantigEn SeLection Alliance,TESLA), 目前已有30 家機構參與,包括頂級基因組研究機 構Broad 研究所,以及百時美施貴寶、阿斯利康這 樣的領軍藥企。TESLA 聯盟成立的目標,是為了 規范和引領腫瘤新生抗原選擇的算法,聯盟內的30 家實驗室將用各自的算法對同一DNA 和RNA 序列 進行預測,希望可以找到最準確的算法,以便用于 個性化腫瘤疫苗的設計,其可以應用于腫瘤疫苗領 域,也可以應用于PD-1 抗體藥物的生物標志物分 析領域。

腫瘤疫苗的理念源自于免疫系統對外來抗原的 殺滅機制,與過去幾十年來尋找腫瘤共同抗原來激 發免疫系統殺死腫瘤相比,關注腫瘤基因組異質性 和抗原差異性的個體化腫瘤疫苗近年來引起更多關 注。2010 年美國食品藥品監督管理局(FDA)批準 了首個癌癥治療疫苗Provenge 用于晚期前列腺癌 的治療,但其效果有限,病人接種疫苗后平均存活 時間只延長4 個月,而且治療費用昂貴,開發公司 Dendreon 也幾經易手。腫瘤疫苗早期研發失敗的部 分原因可能是之前的疫苗開發策略是將全部細胞降 解物作為抗原,導致有效免疫原被無關的抗原掩蓋。 2015 年,Mardis 等對3 位黑色素瘤患者使用了針對 其潛在腫瘤抗原所定制的樹突細胞疫苗,成功地觸 發了患者的免疫反應[23]。2016 年,《自然》雜志專 門介紹了癌癥免疫療法中的個性化腫瘤疫苗[24]。 在國外,同時成立于2015 年10 月的兩家致力 于癌癥新抗原的免疫治療公司:Neon Therapeutics 公司和Gritstone Oncology 公司,分別進行了5500 萬美元和1.05 億美元的A 輪融資。

NGS 技術的進步使得研究人員有望預測出引 發腫瘤特異性免疫反應的腫瘤新生抗原,外顯子 測序和轉錄組測序能準確表征腫瘤細胞的DNA 和 RNA,找出可能引起免疫細胞識別的腫瘤突變,生 物信息學工具的發展則提高了腫瘤新生抗原的篩選 能力[23,25-26],基因組大數據和計算機算法加速了腫 瘤表位預測以及主要組織相容性復合體(MHC)親和 力預測,推動了個體化腫瘤疫苗的發展[27-28]。

2.3 過繼性T 細胞治療

過繼性細胞免疫治療(ACT)是將體外培養、 活化、基因修飾的自體、異體T 細胞或NK 細胞回 輸給患者,旨在利用這些體外“馴化”細胞所擁有的 強大抗腫瘤或抗病毒活性來治療疾病。以CAR-T、 TCR-T 為代表的過繼性T 細胞腫瘤免疫治療具有常 規治療無法比擬的療效和臨床前景,已成為全球腫瘤 治療研發和臨床試驗的熱點。目前過繼性細胞免疫治 療已經進入2.0 時代,不再是簡單地將免疫細胞與腫 瘤共培養再回輸,而是先篩選出最有可能使腫瘤引起 免疫響應的腫瘤新生抗原,再與免疫細胞共培養獲得 特異性靶向病人腫瘤的免疫細胞,回輸病人體內。

例如,腫瘤外顯子測序已經發現,TIL 細胞能 識別和靶向腫瘤突變后形成的肽段,將腫瘤新生抗 原與腫瘤組織在體外共培養,篩選得到特異性靶向 腫瘤的TIL 細胞回輸體內,激活病人免疫系統殺傷 腫瘤的能力,其在黑色素瘤中效果最好。最近報道 的Rosenberg 研究組的針對KRAS 突變的免疫療法, 即是從一位已經發生肺轉移的大腸癌患者的腫瘤組 織里分離出了對突變的KRAS 特異性作用的CD8+T 細胞,這些T 細胞在體外擴大培養后回輸到病人體 內,將病人體內腫瘤一舉殲滅[8]。

CAR-T 細胞治療主要是通過基因修飾獲得攜帶 識別腫瘤抗原特異性受體T細胞的個性化治療方法, 但由于涉及基因修飾,規模化生產和病毒穩定性均 面臨諸多技術障礙。另外,好的特異性靶點也是關 鍵[29-30],CAR-T 技術所針對的靶點是表達在腫瘤細 胞膜上的腫瘤相關抗原,可選擇的范圍較窄,特異 性較差。如表達于B 細胞淋巴瘤細胞表面的CD19 蛋白,也會在正常B 細胞上表達,但在造血干細胞 中不表達,因此副作用只局限在B 細胞。因此, CAR-T 技術所選用的效應細胞來源是個性化的,但 治療靶點是非個性化的,無需通過高通量的檢測手 段配合。相比而言,基于腫瘤新生抗原的細胞治療, 針對的是患者自身腫瘤產生的腫瘤特異性抗原,靶 點類型更加豐富,無需對細胞進行人工改造,但必 須通過基因檢測對腫瘤基因組狀態有全面了解[31]。

2.4 靶向治療+ 免疫治療

在癌癥治療各種手段中,最早也是最直接的是 腫瘤切除,但前提是將體內的腫瘤組織完全拔除, 不留任何腫瘤組織,如休眠癌細胞、耐藥性癌細胞、 轉移腫瘤、手術中的脫落腫瘤等。然后是放化療,化療是化學藥物作用于癌細胞的合成代謝途徑,放 療是利用射線照射腫瘤部位殺死癌細胞。化療是目 前研究的重點,占了很大的比例,現在的化療方式 已經逐漸走向智能化,也就是人們常聽到的靶向治 療,根據癌細胞與正常細胞的物理化學以及基因層 面上的不同,特異性地針對癌細胞的一個或多個特 征,因此,才不斷地有新的腫瘤標志物出現。然而 靶向治療面臨著耐藥性的問題,一旦腫瘤細胞產 生耐藥突變,便會導致靶向藥失效,考慮到腫瘤 基因組的不穩定特性,靶向藥將很難一勞永逸地解 決腫瘤。

腫瘤免疫治療是目前最有可能治愈癌癥的療法, 但也面臨一些問題,如PD-1 抑制劑的治療有效性只 有20% ~ 30%,即使是PD-L1 高表達的腫瘤,如非 小細胞肺癌中,其治療有效性也只有30% 左右。有 效性相對低的原因可能是,腫瘤免疫治療的檢測比 腫瘤靶向藥物治療的檢測更加復雜,涉及的問題很 多,包括基因是否表達、是否有足夠的浸潤淋巴細 胞或γ-干擾素、是否有相關的突變等。

靶向治療依托腫瘤基因組測序找出腫瘤相關性 和特異性的生物標志物,有望彌補免疫治療受益人 群不精準的問題。從長遠角度看,腫瘤未來治療的 最有效方案可能是靶向治療+ 免疫治療。

華盛頓大學醫學院基因組研究所主任Mardis 研究團隊,首先對數名黑色素瘤患者腫瘤及健康組 織樣本的基因組進行了測序,鑒別出腫瘤細胞獨有 的突變抗原,即腫瘤新生抗原,然后利用計算機算 法及實驗室測試,預測出哪些新生抗原最有可能激 發有力的免疫反應并進行測試,最后根據這些結果 開發出個體化的癌癥疫苗,研究結果也證實了這些 定制的疫苗可以激發強有力的免疫反應。盡管還只 是初步的結果,但研究證明了基于免疫的個體化癌 癥治療的可行性[23]。

在商業運作方面,FoundationOne 是Foundation Medicine 公司與紀念斯隆凱特琳癌癥中心聯合開發 的第一個商業癌癥全基因檢測項目,FoundationOne 檢測實體瘤中常見的315 個癌癥相關基因和28 個 基因的選擇內含子,通過對每個癌癥患者的基因改 變匹配不同的治療藥物和臨床試驗,補充傳統癌癥 治療決策工具。此外,Foundation Medicine 公司用 WES 測序和Panel 測序分別評價了突變負載,發現 結果是相關的,表明可以用一個Panel 檢測突變負載, 來預測免疫檢驗點抑制劑的治療效果,突變負載是 識別免疫治療效果的待選標志物之一。

但是,腫瘤的體細胞突變負載并不是最有效或 者最直接的免疫檢驗點抑制劑相關位點檢測的生物 標志物,基因突變導致的腫瘤新生抗原才是腫瘤能 被T 細胞識別并殺傷的關鍵點。在腫瘤新生抗原負 載的評估方面,其質量是比數量更重要的評估方面。 突變是否克隆、是否表達、表達強度,腫瘤新生抗 原親和力、遞呈效率等都是影響腫瘤新生抗原質量 的因素。

3 總結與展望

最近幾十年來,研究人員對免疫系統在腫瘤發 生發展中的作用和認識有了很大進展,基于對免疫 系統與腫瘤相互作用的深刻認識,新的免疫療法不 斷發展,已經在部分癌癥患者上取得良好的臨床進 展。腫瘤免疫治療副作用低于傳統放化療,且能持 續對抗進化的腫瘤系統,然而,由于目前的免疫治 療手段還不夠精準,利用免疫系統殺傷腫瘤的同時 也不可避免對正常組織造成自身免疫反應,并且目 前免疫治療還只能對一小部分癌癥患者有效果。基 于腫瘤特異性抗原(TSAs)的個體化腫瘤治療有望 使未來的腫瘤免疫治療特異性更強,有效性更高, 安全性更好,實現這一目標的過程中還有許多科學 問題有待解決,例如基因突變是否能檢測到、腫瘤 特異性突變抗原與非突變性腫瘤相關抗原效果對比、 新抗原表位最低閾值等,最后還需要通過試驗確定 相關抗原不會導致不可控的自身免疫響應,然后才 能根據這些信息確定適合患者的個性化腫瘤免疫治 療方案:是個性化腫瘤疫苗、還是精準過繼性細胞 治療、還是跟免疫檢查點抑制劑療法結合、還是與 傳統放化療手段聯用等?

所有這一切都離不開腫瘤基因組大數據研究和 算法分析,全基因組、外顯子、轉錄組、免疫組等 測序技術因能對腫瘤- 免疫學過程的發現、理解提 供更為全面的認識,越來越成為腫瘤免疫治療不可 缺少的關鍵,而生物信息學分析和人工智能結合提 供了預測腫瘤變異和新生抗原的前沿工具。這些方 法將從更加全面的腫瘤基因大數據中尋找能揭示特定免疫治療獲益性臨床指標和治療靶點。 可以預見的是,為了實現腫瘤精準免疫治療的目 標,找出適合病患的個體化治療方案,需要對包括免 疫檢查點分子的表達、腫瘤突變負載、預測性腫瘤新 生抗原、腫瘤微環境、腸道菌群組成等眾多影響因素 進行全面的評估,基因檢測與生物信息學分析將能夠 為理解免疫系統和腫瘤之前相互關系搭建一座橋梁。 基于高通量測序的生物標志物發現,基于生物信息分 析的大數據研究將指引更加精確的腫瘤免疫治療。

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