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基因組工程在微生物細胞工廠構建中的應用進展

時間:2018-05-29來源:未知 作者:何慶 王茜 朱清華 方宏清 點擊:

基因組工程是指為了實現某一目標對復制 系統進行有意的、廣泛的遺傳修飾。目前,人們 對基因組工程的研究正處于快速上升時期。以微 生物細胞工廠替代傳統化工廠,將可再生資源轉 化為人類所需的能源、藥物、化工原料等,是綠 色發展的重要途徑之一。目前,以基因組工程為 基礎的微生物細胞工廠的構建主要有兩條技術路 線:合成簡約化的基因組;剔除贅余基因以獲得 簡約化的基因組。第一條技術路線是以人們對生 物體系研究所獲得的技術與知識為基礎,將零部 件一步步組建成生物體,重塑生命是其核心思想。 第二條技術路線為大多數研究人員所采用,它主 要針對遺傳背景較為清晰的微生物,通過對其基 因組的結構和序列進行分析,分批次敲除非必需 或贅余的基因序列,或通過添加DNA 序列增加 新的功能,提高細胞對底物和能量的利用率以及 生產性能。

1 基因組改造技術

基因組靶向編輯指在基因組DNA 的預定位點 上,精確地改變DNA 序列,包括插入、缺失和置換 等,進而改變基因的結構或功能。該技術是微生物 細胞工廠構建中最常用的技術。

1.1 λ Red 同源重組和CRISPR 技術

λ Red 同源重組是一項可在染色體水平進行遺 傳操作的技術,只需較短的同源序列,不需要特定 的限制性酶切位點,即可在生物體內完成重組過 程。而CRISPR/Cas9(clustered regularly interspersed short palindromic repeats/Cas9)技術是由RNA 指導 Cas9 蛋白對靶基因進行修飾,具有組成簡單、價格 低廉、安全性高、切點相對精確、具有可逆性、可 同時對多個基因位點進行編輯的優點,被廣泛應用 在不同微生物中(表1)。

目前,人們致力于將λ Red 重組酶與CRISPR/ Cas 技術相結合,結合后的系統不僅能夠發揮λ Red 重 組酶高效重組的優點,還利用了CRISPR/Cas 識別特 異性序列并產生雙鏈斷裂的特點。如Reisch 等[10]發明的no-SCAR(scarless Cas9 assisted recombineering) 利用λ Red 促進供體DNA 的基因組整合,然后利用 Cas9 切割的雙鏈DNA 來篩選突變株,可實現無痕 基因組編輯。Carlotta 等[11]在MAGE 技術的基礎上結 合CRISPR/Cas9 與λ Red 重組,創造出了一種適用于 大腸桿菌的高效快速的基因組工程方法CRMAGE, 該方法對3 個基因組靶標的重組效率高達96.5% ~ 99.7%。

1.2 大片段捕獲、合成及組裝

DNA 片段的克隆和組裝技術是分子生物學的重 要工具。近年來,隨著合成生物學的發展,對大片段 的捕獲和有效組裝顯得尤為關鍵。雖然傳統的利用Ⅱ 型限制性內切酶連接克隆的策略仍然在發揮著重要作 用,但由于酶切位點的限制,其在多DNA 片段組裝或者 平行無縫克隆方面不足之處也盡顯無遺[12]。為此,人們 基于PCR、非典型酶切連接、單鏈退火拼接、同源重 組等原理,開發出了一系列大片段DNA 克隆與組裝 技術,為微生物細胞工廠的構建提供了有效的操作工 具。但這些方法均有其各自的適用范圍,還沒有一種 方法可以在滿足快速平行組裝(無痕、無序列依賴性、 可按預設順序組裝)的同時,適用于生物合成途徑乃 至基因組的組裝。因此,目前最常用的策略是依據目 標DNA 分子尺度、序列的同源性程度和能否容忍疤 痕的存在,將幾項最合適的技術聯合使用。

一些新方法和新技術的出現,使大片段捕獲、 合成及組裝操作變得簡單。如應用Red 重組直接從 體內克隆染色體上大于10kb 的DNA 序列非常困 難,但朱瑩等利用一種抗性拆分- 融合策略成功地 將供體菌基因組上約48kb 的大片段DNA 捕獲至質 粒載體上,并將其移植到了受體菌的染色體上,一 次敲除了基因組中4 個非必需區,該方法的發明將 有利于基因組組裝和大片段DNA 的功能研究[13]。Red/ET 重組是一種基于體內同源重組的技術,該技 術不受限制位點位置和DNA 片段大小的限制。Bian 等[14]利用RecE/EecT 介導的大腸桿菌線性加線性同 源重組(linear plus linear homologous recombination, LLHR)從丁香假單胞菌的基因組中直接克隆了 syringolin 基因簇,并在大腸桿菌中成功地進行了異 源表達。Huang 等[15]更是將用迭代重組的方法組裝得 到的多殺菌素基因簇替換了糖多孢菌體內天然紅 霉素聚酮化合物合酶基因,并獲得了成功的表達。 此外,還有許多其他的基因組改造方法,如RNA 干擾[16]、PCR 介導染色體分裂技術[17]等。

2 基因組工程在不同微生物細胞工廠中的 應用

2.1 基因組工程在大腸桿菌細胞工廠中的應用

大腸桿菌是使用最廣泛的異源表達宿主菌。各 大類天然產物,如非核糖體肽類、聚酮類、苯丙烷 類和萜類化合物,都能在大腸桿菌內異源合成。自 2002 年發表了第一篇大腸桿菌基因組簡約化的報道 后,關于大腸桿菌基因組精簡的報道如雨后春筍。 Shalini 等[18]構建了一系列可用于單拷貝DNA 序列 整合或者啟動子區置換的模板質粒,如pSD1xx 和 pSD2xx,并通過實驗證明了其有效性。Wei 等[19] 利 用基因組工程方法構建了大腸桿菌突變株DOPA- 30N,3,4-二羥基苯基-L-丙氨酸(L-DOPA)產量在 5L 發酵罐中60h 能夠達到8.67g/L。上述研究成果 表明,基因組的精簡往往能夠獲得意想不到的優良 屬性,同時也大大鼓舞了人們構建大腸桿菌細胞工 廠的想法。

將λ Red 重組與CRISPR/Cas9 相結合的策略,不 僅能夠解決DNA 大片段或者代謝途徑組裝過程中面 臨的問題,而且已經在很多研究中獲得了成功。如Chung 等[1]基于上述策略發明了一種大片段基因精 確整合的方法,能夠將7kb 的雙鏈DNA 整合到大腸 桿菌基因組中,且效率超過了60%。Pyne 等[2] 開發 了一種三質粒方法,不僅能夠對短單鏈寡核苷酸進行 高效重組,還能用大片段的PCR 產物替換染色體延 伸片段上的多基因。上述基因組編輯的方法將在大腸 桿菌細胞工廠的構建中發揮越來越重要的作用。

2.2 基因組工程在釀酒酵母細胞工廠中的應用

釀酒酵母是代謝工程中應用最廣泛的模式生物 之一,是人們研究細胞周期、蛋白質相互作用的首 選模式生物。酵母細胞工廠對于真菌和植物來源的 次級代謝途徑有良好的適應性,然而質粒拷貝數控 制不佳和對持續選擇壓力的需求限制了其在工業發 酵上的穩定性。因此,更多先進的基因組編輯技術 在酵母中使用并獲得了成功。如Murakami 等[17] 通 過分析釀酒酵母染色體基因,利用PCR 介導染色體 分裂技術,獲得了缺失531.5kb 的基因組簡化菌株, 其乙醇和甘油產量分別是野生株的1.8 倍和2 倍。 目前,人們已經能夠利用CRISPR/Cas9 系統 對酵母菌進行基因插入和敲除。Bao 等[3]開發了HICRISPR( homology-integrated CRISPR-Cas) 技術 并首次在釀酒酵母內一步成功敲除了CAN1、LYP1 和ADE2 基因。Shi 等[4] 研制出Di-CRISPR(delta integration CRISPR-Cas)平臺,利用該平臺可實現 無痕的多基因整合,甚至完整代謝途徑的整合將成 為可能。

總之,同源重組技術結合CRISPR/Cas9 技術后, 將成為無痕、一步基因敲除與整合、多基因生物合 成途徑組裝的強有力的工具。再通過利用靈巧的多 gRNA 克隆表達元件,將來一定能夠為人們提供穩 定性更強的工程化的酵母基因組[20]。

2.3 基因組工程在鏈霉菌細胞工廠中的應用

鏈霉菌細胞工廠的優點主要體現在3 個方面:

①作為多種次級代謝產物的產生菌,鏈霉菌體內豐 富的初級代謝途徑可以提供充足的前體供應;②鏈 霉菌具有獨特的轉錄后修飾系統,如磷酸泛酰巰基 乙胺基轉移酶催化的反應是Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)及非核糖體肽合成酶(nontibosomal peptide synthetase, NRPS)中關鍵的蛋白修飾;③如 果在鏈霉菌自身優良特性的基礎上,能夠利用基因 組工程開發出培養條件、遺傳操作和生長速度接近 大腸桿菌的突變株,將成為合成生物學領域的標志 性成果[21]。因此,全世界的科學家一直對鏈霉菌基 因組工程的研究情有獨鐘。

目前,鏈霉菌細胞工廠的構建主要包括以下幾 種策略:基因組的精簡和優化、對各類調控子進行 改造和增加前體供應。在此基礎上,人們已開發出阿 維鏈霉菌、天藍鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、白色鏈霉菌 和委內瑞拉鏈霉菌等鏈霉菌底盤宿主。Wang 等[22]以 鏈霉菌FR008 為初始菌株,經過遺傳改造后獲得了 一系列優勢底盤,這些底盤遺傳操作非常容易,且 是目前常見鏈霉菌中生長速度最快的。

CRISPR/Cas9 技術的出現能夠解決鏈霉菌基 因組編輯過程費時費力的難題。人們已經用Ⅱ型 CRISPR/Cas 系統在變鉛青鏈霉菌、白色鏈霉菌和 產綠色鏈霉菌中成功地進行了多基因的缺失,編輯效 率大于70%[5]。如Cobb 等[6] 利用含有嵌合gRNA 的 pCRISPomyces-2 系統不僅高效地完成了單基因和雙 基因的敲除,還實現了30kb 大基因簇的缺失。Hu 等[23] 將CRISPR/Cas9 和CodA(sm)組合后,發明 了能夠快速、高效地編輯鏈霉菌基因組的CRISPR/ Cas9-CodA(sm)系統。Huang 等[24]構建了一個適合 鏈霉菌基因操作的高效CRISPR/Cas9 基因組編輯質 粒pKCcas9dO。相信在未來,隨著類似于CRISPR/ Cas 的技術在鏈霉菌中廣泛應用,將誕生更多性能優 越的鏈霉菌宿主,為鏈霉菌細胞工廠的構建以及新藥 的研制提供強有力的支持。

2.4 基因組工程在枯草芽孢桿菌細胞工廠中的應用

枯草芽孢桿菌是工業生產中許多生物制品的宿 主菌。作為一種底盤細胞,人們已經致力于用多種 基因組工程的方法對其基因組進行精簡以提高它的 性能和適用性。如Toya 等[25] 構建的纖維素酶產生菌 MGB874 精簡了約20.7% 的基因組,在生產堿性纖 維素酶和蛋白酶時表現出了明顯的優勢。除了能夠 生產多種酶類之外,枯草芽孢桿菌還可以用來生產 一些小分子化學物質,如核苷、核黃素、2,3-丁二醇 和乙酰甲基原醇等。Li 等[26]對枯草芽孢桿菌168 的 基因組進行了581.9 ~ 814.4 kb 的精簡,構建了多株突變株,發現它們在生長速率、產孢率、轉化效 率等方面呈下降趨勢。但重新引入外源基因后,鳥 嘌呤和胸腺嘧啶產量分別是野生株的4.4 倍和5.2 倍。

新的基因組編輯技術在枯草芽孢桿菌中的應用 也日益增多。如Josef 等[7]構建了一個可用于枯草芽 孢桿菌基因組編輯的單質粒系統,成功地敲除了枯 草芽孢桿菌染色體上的兩個大片段,并對枯草芽孢 桿菌168 中的trpC2 基因突變進行了修復。Westbrook 等[8]建立了一套綜合改造枯草芽孢桿菌的CRISPR/Cas9 工具包。因此,我們有理由相信,隨著更多先進的基 因編輯技術的應用,將大大推動枯草芽孢桿菌工廠的 構建進程。

2.5 基因組工程在乳酸菌細胞工廠中的應用

乳酸菌具有良好的生物安全性,是公認的安全 級微生物。人們已經完成了多種乳酸菌基因組的測 序,發現同其他微生物一樣,其基因組內含有大量 的非必需基因。目前,大部分乳酸菌基因組簡化研 究尚不成熟,基因敲除技術還依賴于傳統的同源重 組技術,其敲除策略大致可分為3 類:位點特異性 重組、同源單交換基因敲除和線形DNA 重組基因 敲除[27]。

位點特異性重組體系由重組酶和特異性識別位 點組成,該系統具有高度的專一性和保守性。Cre/ loxP 系統和TP901-1/att 系統常用于乳酸菌的位點 特異性重組。如Qiao 等[28] 把質粒pNZ5319 轉化入 乳酸乳球菌進行同源重組,隨后引入Cre/loxP 系 統消除篩選標記,成功敲除了胸腺嘧啶合成酶基 因thyA。由于乳酸菌含有一層較厚的細胞壁,導致 對其進行遺傳操作較困難,重組效率一般較低,但 仍然可以通過優化相關因素(如引入反向篩選標記 和利用溫敏復制子)提高敲除效率。Langa 等[29] 利 用敲除載體pORI28(repA-)和溫敏質粒pVE6007 (repA+)共同敲除短乳桿菌pdh30 基因,發現該基 因參與3-羥基丙酸的生物合成。

CRISPR/Cas 技術未來極有可能在乳酸菌中得以 廣泛應用。van Pijkeren 等[9] 已嘗試把CRISPR/Cas 系 統和單鏈重組系統結合后應用于乳酸菌中。Millen 等[30]從遺傳水平對CRISPR/Cas 系統在乳酸菌細胞內 的有效性進行了研究,結果表明CRISPR/Cas 系統 在乳酸菌內部有效且應用前景廣闊。此外,ZFNs 和 TALENs 等高效靶向基因修飾技術都有待應用于乳 酸菌中,這將極大地提高基因敲除效率,為乳酸菌 細胞工廠的構建提供強有力的工具。

3 總結與展望

 

利用微生物細胞工廠生產化工和醫藥產品具 有高效、清潔、附加值高等優點,已成為綠色工業 發展的核心部分。特定環境下,維持細胞正常代謝 所需的最小基因群構成了該細菌的最小基因組。 Masaomi 等[31] 對缺失了不同贅余基因組序列大小的 大腸桿菌突變株的生長情況進行了分析,發現它們 的指數增長率和飽和細胞密度按照與缺失長度成正 比的方式下降,并且該現象與培養基無關。因此, 如何在保證微生物基本正常生長的條件下,利用最 小基因組作為底盤構建相應的微生物細胞工廠,是 需要進一步研究的問題。在對不同微生物基因組的 精簡過程中,CRISPR/Cas9 系統因其獨特的優勢成 為當前的研究熱點。

目前,雖然有很多活性化合物及其衍生物在微 生物細胞工廠中成功進行了異源表達,但同時也發現 了一些令人費解的現象[32]。如Smanski 等[33]曾嘗試在 S. lividans K4-114、S. coelicolor(CH999、M1146、 M1154)和S. albus J1074 中對平板霉素基因簇進行 異源表達,但只在S. lividans 中獲得成功,且是在敲 除了途徑特異性調控基因ptnR1 之后,導致這一結果 的原因尚不清楚。因此,一方面需要對合成代謝途徑 的調控系統及其底盤適配性的問題進行深入研究,另 一方面,由于任何一種微生物包含的代謝途徑不能夠 滿足所有天然產物異源表達的需求,故開發性能優良 且各具專長的底盤細胞尤為緊迫。

隨著基因組工程技術的日新月異,將誕生更多 優良的超級微生物細胞工廠,它們遺傳操作快速高 效、本底代謝競爭途徑少、培養條件簡單、標準化元 件充足、異源化合物提取分離方便、穩定且高產,將 為新藥研發和天然化合物產業化提供更強大的支持。

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