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基于文獻計量的基因組編輯技術發展態勢分析

時間:2018-05-29來源:未知 作者:王慧媛 袁天蔚 阮亮亮 熊燕 點擊:

自2013 年首次報道CRISPRCas9 系統成功在哺乳動物基因組 編輯中應用以來,以CRISPR 為 代表的基因組編輯技術受到廣泛 關注。基因編輯技術是對目標基 因序列進行插入、刪除或者改變 的操作方法。從鋅指核糖核酸酶 (ZFN)技術、轉錄激活因子樣 效應物核酸酶(TALEN)技術到 現在的RNA 介導的成簇規律間 隔短回文重復序列系統(CRISPR) 技術,基因組編輯技術成為生命 科學研究的一項重要技術。尤其 是CRISPR 技術,自2012 年問世 以來,在短短幾年內迅速席卷全 球各實驗室,并展現出廣闊的應 用前景,被認為是遺傳研究領域 的革命性技術,已應用于作物育 種、疾病模型構建、靶向藥物研 發等各個領域。采用文獻統計、 共被引分析和關鍵詞共現分析 等文獻計量方法,對基因組編輯 技術近十年的相關文獻進行分 析,總結技術發展路徑和研究現 狀,并對未來的研究熱點趨勢進 行展望。

1 基因組編輯技術發展迅速

基因組編輯依賴于位點特 異的核酸內切酶在剪切位點通過 DNA 修復系統觸發序列修改。目 前,在該領域主要有三種技術,即 ZFN 技術、TALEN 技術和CRISPR 技術。

TALEN 技術與ZFN 技術組 成了一大類強有力的基因組編 輯工具,由一個可編碼的序列特 異性DNA 結合模塊與一個非特 異性的DNA切割結構域所組成, 通過誘導DNA 雙鏈斷裂來刺激 容易出錯的非同源末端連接或 在特定基因所在的位置進行的 同源定向修復,完成一系列基因 編輯操作。CRISPR 技術是最新 出現的一種基因組編輯工具,與 其他基因組編輯工具相比,更易 于操作,有更強的可擴展性。

利用Web of Science 數據庫, 檢索2006 ~ 2016 年的基因組編 輯技術相關文獻(檢索時間為 2016 年11 月8 日,數據更新時間 為2016 年11 月4 日)。2006 年 以來,共獲得基因組編輯技術研 究相關文獻8176 篇。2015 年發文 量為1964 篇,是2006 年發文量(62 篇) 的31.68 倍。2016 年( 數據 截至2016 年11 月8 日)為2145篇,已經比2015 年增長了9.22%。 2006 ~ 2015 年,基因組編輯技 術研究發文量的平均年增長率為 47.94%,發文量呈快速增長的趨 勢(圖1)。

2 美國引領基因組編輯技術 研究

2006 ~ 2016 年全球發表的 基因組編輯技術論文中,美國 以4090 篇的發文量位居世界第 一,占全球該領域發文總量的 50.02%。中國以992 篇的發文量 排名第二,占全球該領域發文總 量的12.13%,發文量排名前五的 國家還有德國、英國、日本(圖2)。

2006 ~ 2015 年,基因組編 輯技術論文發文量排名前五的國 家中,美國的發文量增長速度最 快, 從2006 年的36 篇增長到 2015 年的993 篇(2016 年數據不 全,此處只做趨勢觀察,不做年 度統計),發文量增長了近26.58 倍,平均年增長率達44.90%。中 國從2007 年才開始有基因組編 輯技術的相關文獻報道,發文量 以緩慢的速度平穩增長。2012 年 開始,中國的發文量快速增長, 2014 年達到189 篇,超越德國, 位居全球第二(圖3)。

2006 ~ 2016 年,在基因組 編輯技術領域,美國發表的論文 的篇均被引頻次達到26.93 次,h 指數高達135,擁有較多的高質 量論文。中國盡管在發文量上排 在全球第二,但其論文的總被引 頻次只有15 416 次,篇均被引頻 次僅為15.54 次,在發文量排名 前十位的國家中排名靠后,而法 國、加拿大、荷蘭、意大利、西班牙的篇均被引頻次都達到20 次 以上(表1)。

2006 ~ 2016 年,全球基因 組編輯技術相關論文8176 篇, 總被引頻次為155 810 次,篇均 被引頻次為19.06 次。將某一時 間段各國論文的篇均被引頻次與 該時間段全球篇均被引頻次相 比,得到各國篇均被引頻次的相 對數值,將這一指標稱為標準引 文影響指數(normalized citation impact,NCI),國際篇均被引頻 次作為基線1,NCI 可以從一個 角度反映一個國家在該領域的研 究水平。

發文量排名前十位的國家 中,美國、法國、加拿大、荷蘭 和西班牙在基因組編輯領域的研 究高于全球平均水平,德國和意 大利與全球平均水平相當,英國 略低于全球平均水平,而中國和 日本的NCI 分別為0.82 和0.66, 低于全球平均水平(圖4)。

3 中國研究機構在基因編輯 技術研究領域論文發文量表 現突出

2006 ~ 2016 年全球基因組 編輯技術論文發文量排名前十位 的研究機構如圖5 所示。哈佛大 學以390 篇的發文量排名首位; 中國科學院排名第二(260 篇), 是唯一進入全球前十的中國研究 機構。

2006 ~ 2016 年,基因組編 輯技術論文發文量排名前十的機 構中,美國麻省理工大學的篇均 被引頻次最高,達到94.38 次, 其次是哈佛大學,篇均被引頻次 為69.80 次。中國科學院盡管發文量排名第二位,但篇均被引頻 次僅為17.41 次,與其他機構相 比,整體發文質量仍有一定差距。 從h 指數來看,哈佛大學的h 指 數較高(74),擁有較多的高質 量論文(表2)。

2006 ~ 2016 年,基因組編 輯技術論文發文量排名前十的中 國機構中,中國科學院以260 篇 的發文量排名第一,占中國基 因組編輯技術研究論文總量的 26.21%。從h 指數來看,中國科 學院的h 指數為31,遙遙領先于 其他國內機構。清華大學的篇均 被引頻次最高,達到64.10 次, 其次是北京大學,篇均被引頻次 為38.01 次。這兩所高校在基因 組編輯技術領域的論文總體質量 較高(表3)。

4 基因組編輯技術領域的革 命性技術——CRISPR 技術

為了研究基因組編輯的技術 發展路徑,運用信息可視化軟件 CiteSpace 繪制知識圖譜并計量 分析數據,對2006 ~ 2016 年基 因組編輯相關文獻的共被引和關 鍵詞共現情況進行分析(圖6), 梳理基因組編輯的技術路徑, 可以看出,CRISPR 技術無疑是 基因組編輯技術領域的革命性突 破。CiteSpace 是應用于Java 環 境下的可視化軟件,基于對特定 領域文獻集合的計量,通過知識 圖譜的繪制,能夠對CRISPR 技 術的知識結構、研究演進以及熱 點和前沿主題進行定量與定性 分析。

CRISPR 是一類廣泛分布于 細菌和古菌基因組中的重復結構。研究表明,CRISPR 與一系列相關 蛋白、前導序列一起,能為原核 生物提供對抗噬菌體等外源基因 的獲得性免疫能力。這種結構 的作用機理可能與真核生物的 RNA 干擾過程類似,最早于1987 年在大腸桿菌(Escherichia coli) K12的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein)基因側翼序列 中被發現 。2005 年左右,CRISPR 位點附近高度保守的Cas 基因 (CRISPR-associated genes) 引起 了研究者關注。Cas 基因是一類 基因家族,編碼具有核酸酶和解 旋酶結構域的蛋白質。2005 年, Daniel 等[2] 在原核生物中發現了基 因序列中包含45 個CRISPR-Cas 系統的蛋白家族和多個CRISPRCas 亞型的集合,這些集合顯示了 高度的靈敏性和特異性。2007 年 3 月,Barrangou 等[3]在《Science》 上發表文章稱,CRISPR 與Cas 構 成的CRISPR-Cas 系統能夠使細 菌抵抗噬菌體,從而免受病毒和 質粒侵害,在此基礎上,研究人 員逐步探明了CRISPR-Cas 系統 詳細的免疫機制,為CRISPR-Cas 系統發展成為通用的RNA 介導的 可編程DNA 核酸內切酶輔平了 道路,這篇文章成為了CRISPRCas 系統作為基因組編輯工具的 奠基性研究。隨后,科學家們陸續對CRISPR-Cas 的作用機制進行 了深入研究,例如2008 年荷蘭瓦 赫寧根大學的Brouns 等[4] 發表在 《Science》上的文章,報道了原 核生物中小CRISPR RNA(small CRISPR RNAs)介導的抗病毒防 御, 闡述了包含在CRISPR-Cas 中的病毒衍生序列如何使用來自 宿主的CRISPR 相關蛋白Cas 介 導抵抗感染的抗病毒反應。直到 2012 年8 月,加州大學伯克利分 校的Jinek 等[5] 發表在《Science》 雜志上的文章,正式提出利用 RNA 介導CRISPR-Cas 系統可 實現基因組編輯,證明CRISPRCas 系統可作為基因組編輯工具, CRISPR-Cas 基因組編輯技術瞬間 吸引了全球研究者的目光。該文 章被引用1290 次,成為近幾年來 CRISPR 技術大熱的起點。

5 有效性驗證和應用研究是 基因組編輯技術研究的熱點

利用作者從論文中抽取用于 表征論文的主題特征的關鍵詞,可 以分析出一定研究領域的熱點和 前沿主題。在CiteSpace 軟件中, 選擇網絡節點類型為“keywords” ( 關鍵詞), 參數閾值設置為 “top 50”(每年出現頻次最高的 前50 位關鍵詞),繪制關鍵詞共 現知識圖譜(圖7)。分析2006 ~ 2016 年基因組編輯技術相關的 8176 篇文獻,共出現14 142 個關 鍵詞。綜合來看,2006 ~ 2013 年, 頻次和中介中心性較高的關鍵詞分別 是zinc fi nger nuclease(鋅指核酸酶)、DNA express system(DNA 表達系統)、Escherichia coli( 大 腸桿菌)、DNA binding specifi city (DNA 結合特異性)、homologous recombination(同源重組)、雙 鏈斷裂fragment-length-polymorphism ( 片段多態性)、endonuclease (核酸內切酶)等。這期間的研究 熱點在于對上一代基因組編輯技術 ZFNs、TALANs 等的深入研究和對 CRISPR 技術的分子機制研究。

2013 年以后的高頻詞和高中介中心 性關鍵詞為prokaryote(原核細胞)、 mice( 小鼠)、mammalian cell ( 哺乳細胞)、CRISPR/Cas9、 pluripotent stem cell (多能干細胞) 等,研究熱點集中在以CRISPR 技術為代表的基因組編輯技術在 不同系統中的有效性驗證及應用。 2013 年以來,基因組編輯技 術領域不斷取得突破性進展,大 部分都是圍繞CRISPR 技術展開。 科學家們紛紛在細菌、斑馬魚、小 鼠、小麥、水稻、哺乳動物甚至人 類等不同生物系統上驗證CRISPR 的 有效性,例如,Hsu 等[6] 利用產膿 鏈球菌(Streptococcus pyogenes) 中的Cas 酶(SpCas)和RNA,在 小鼠和人類細胞的DNA 中進行 了插入、修改、敲除基因片段, 首次證明了Cas9 核酸酶能用于哺 乳動物細胞基因組的編輯;Cong 等[7] 將多個引導序列編碼到單個 CRISPR 陣列中,使得能夠同時編 輯小鼠基因組內的多個位點,展 示CRISPR 技術在小鼠體內進行 多位點編輯的有效性;Jiang 等[8]利 用CRISPR-Cas 系統進行RNA 指 導的細菌基因組編輯,利用Cas9 核酸內切酶結合雙股RNA 在肺炎 鏈球菌和大腸埃希氏菌基因組中實現精確的基因突變;Hwang 等[9] 發現細菌II 型CRISPR-Cas 能夠 在斑馬魚胚胎中誘導產生靶向遺 傳修飾,其效果與ZFN 和TALEN 的效果相類似;Ding 等[10]利用 CRISPR 技術進行人多能干細胞 基因組編輯,并指出CRISPR 較 ZFN 和TALEN 具有極大的優 勢,CRISPR 更易于操作,也具 有更強的擴展性;Shan 等[11] 利 用CRISPR-Cas 系統定點突變了 水稻和小麥兩個作物的OsPDS 和TaMLO 等5 個基因, 首次證 實CRISPR-Cas 系統能夠用于植 物的基因組編輯;Niu 等[12]利用 CRISPR技術實現猴的基因編輯, 提示該技術進行人基因組編輯的 可能性。

同時,以CRISPR 為代表的 基因組編輯技術在疾病治療、動 植物品種改造等應用方面的研究 也取得較大進展。研究人員已經 利用CRISPR 技術在疾病治療領 域取得諸多突破,包括構建衰老 模型[13]、改造艾滋病毒[14]等,尤 其是成功編輯T 細胞[15],為與自 身免疫相關的1 型糖尿病、艾滋 病、癌癥等多發性疾病提供了新 的治療途徑。在癌癥治療領域, 研究人員利用CRISPR 技術鑒別 和篩選癌癥相關基因[16]、精準控 制基因表達[17]、構建癌癥類器官[18] 等。此外,CRISPR 也可用于設 計干細胞,開發疾病研究和藥物 測試模型[19],并有望應用到誘導 多能干細胞中[20],實現個性化的 干細胞治療,造福多種遺傳學疾 病的患者。在動植物分子育種方 面,在利用CRISPR-Cas 系統定 點突變了水稻和小麥基因的基礎 上,Ji 等[21] 利用CRISPR-Cas 特 異識別病毒和外源DNA的特性, 將CRISPR 切割系統引入植物, 在植物中建立了DNA 病毒防御 體系;CRISPR 技術也被廣泛用 于山羊、豬、狗等動物品種的改良上。除了應用于疾病治療和物種 改良,CRISPR 在其他應用領域也 發揮著重要的作用,如銷除“轉 基因”生物中特定序列[22]、光控 CRISPR-Cas9 系統[23]、制備新型 gRNA 文庫[24]等。

在多種系統中成功應用CRISPR 技術之后, 科學家們更加關注 CRISPR 技術應用于人類基因組 編輯。2015 年,我國中山大學生 命科學學院黃軍就在《Protein & Cell》雜志發表文章稱,其團隊成 功修改了人類胚胎的DNA,為治 療地中海貧血癥提供了可能[25]。 這是CRISPR 技術首次應用于人 類胚胎編輯,盡管引發了基因組 編輯技術倫理和監管問題的巨大 爭議,但仍是該基因組編輯技術 應用研究的重要突破,黃軍就也 因此入選了《Nature》2015 年度 十大人物。

6 總結與展望

隨著基因組編輯技術飛速發 展,尤其是CRISPR 技術的不斷 應用與探索,相關研究發文量逐 年迅速增長。美國引領了基因組 編輯技術的研究,其發文量占全 球發文量的近一半,且發文質量 整體水平較高。中國后來居上, 在基因組編輯領域的研究實力強 勁,尤其是中國科學院,在發文 量上僅次于哈佛大學,其發文整 體實力與高質量論文量在國內也 處于領先地位。基因組編輯技術 發展過程中,CRISPR 技術無疑是 該領域的革命性技術。

近年來,基因組編輯的研究 熱點都圍繞著CRISPR 技術展開, 從作用機制到不同系統的有效性驗證,再到技術應用,基因組編 輯的應用潛力不斷被挖掘,在藥 物開發、疾病治療、動植物改造 等領域發揮著越來越重要的作 用。利用基因組編輯技術尋找、 確定和制備藥物篩選靶(分子藥 靶)已成為新藥研發的新思路; 基因組編輯技術越來越普遍地 用于作物育種。此外,研究人員 也在不斷探索如何減少基因組 編輯技術的脫靶效應,提高系統 效率和特異性,尋找更高效的編 輯系統或工具等,對脫靶效應的 研究使得該技術更為精準,“精 準基因組編輯”正逐步實現。而 具有多重功能或更大識別序列 的新系統也在不斷被發現。此 外,隨著基因組編輯技術成功 應用于人類胚胎,該技術的快 速發展所帶來的倫理和監管問 題也得到廣泛關注和探討。

 

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